PCR儀優(yōu)化樣品條件以增強目標(biāo)核酸序列的擴增，以進行定量和定性分析。熱循環(huán)儀設(shè)計用于執(zhí)行兩種類型的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 方法：終點或標(biāo)準(zhǔn) PCR 和實時 qPCR。
標(biāo)準(zhǔn) PCR儀可擴增目標(biāo) DNA 或 RNA 序列，但不包括用于實時測量擴增速率的軟件（或檢測器）。
實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)和標(biāo)準(zhǔn) PCR 系統(tǒng)有什么區(qū)別？
實時 PCR 系統(tǒng)定量 PCR 反應(yīng)進行時產(chǎn)生的目標(biāo) DNA 或 RNA 的拷貝數(shù)，建立與反應(yīng)中擴增開始呈指數(shù)增加時的點相關(guān)的 Ct 值（或閾值循環(huán)）。因此，實時 PCR 系統(tǒng)提供樣品的定性和定量檢查，而標(biāo)準(zhǔn) PCR 系統(tǒng)僅提供樣品的定性分析。
標(biāo)準(zhǔn) PCR 系統(tǒng)包括樣品塊（與微孔板、微管或 PCR 條兼容）、加熱和冷卻元件以及板載控制器。熱量通過 Peltier 效應(yīng)在元件和樣品塊（包含樣品）之間傳遞，確保快速升溫和冷卻速率以及嚴(yán)格的溫度容差。
實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)的功能還包括樣品塊、加熱/冷卻元件和控制器，以及光源（通常是鎢燈）、濾光片和光檢測器。實時 PCR儀的板載軟件包括附加功能，可在反應(yīng)發(fā)生時繪制反應(yīng)結(jié)果圖表，將擴增曲線作為 Ct 值分配給每個陽性樣本。
在將樣品裝入PCR儀之前，PCR 反應(yīng)必須包含多種試劑（或預(yù)混液）以確保目標(biāo)序列的成功擴增。對于標(biāo)準(zhǔn) PCR 反應(yīng)，樣品必須包括目標(biāo)核酸、無核酸酶（PCR 級）水、dNTP（二核苷酸三磷酸）、DNA 聚合酶和設(shè)計用于結(jié)合目標(biāo)基因上游和下游的定制寡核苷酸序列。對于實時 PCR 反應(yīng)，樣品必須包含上述每種試劑，以及設(shè)計用于與目標(biāo)序列退火的熒光探針或報告分子。
標(biāo)準(zhǔn) PCR 方案包括一個初始步驟，然后是一個精確的 2 步溫度序列，重復(fù) 40 個循環(huán)。第一步或變性步驟包括將樣品加熱至 95°C 3 分鐘，以將雙鏈目標(biāo) DNA 分離或變性成單鏈。第二步，稱為退火步驟，包括將樣品冷卻至 60°C，這是引物和 DNA 聚合酶與靶序列結(jié)合或退火的理想溫度。第三步或延伸步驟涉及將樣品加熱到 72°C，以允許 DNA 聚合酶使用 dNTP（或二核苷酸三磷酸）形成新的 DNA 互補鏈。退火和延伸步驟重復(fù) 39 個額外的循環(huán)，以形成數(shù)百萬個目標(biāo) DNA 序列拷貝。
實時 PCR 協(xié)議反映了標(biāo)準(zhǔn) PCR 協(xié)議，但有一個例外：退火步驟還涉及熒光探針或報告分子與目標(biāo) DNA 鏈的結(jié)合。由于 DNA 聚合酶在延伸步驟中形成新的互補鏈，探針會發(fā)出特定波長的光。當(dāng)反應(yīng)通過 40 個循環(huán)協(xié)議進行時，檢測器會測量光，從而使研究人員可以按需分析每個樣品中的放大率。由于實驗方案的不同而存在一些差異，正常的 PCR 運行時間在 90 到 100 分鐘之間。
安裝在標(biāo)準(zhǔn) PCR儀上的板載軟件包括反應(yīng)方案的輸出、定義當(dāng)前反應(yīng)步驟的狀態(tài)指示器和估計的完成時間。更高級的標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)儀包括用戶定義的協(xié)議、密碼保護和溫度優(yōu)化向?qū)А?/p>
標(biāo)準(zhǔn)和實時熒光定量 PCR 用于各種應(yīng)用，包括法醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、臨床診斷（例如 COVID 檢測）、克隆、基因分型、突變檢測（用于癌癥篩查）和親子鑒定。
在實時定量 PCR 中，目標(biāo)序列或擴增子在反應(yīng)進行到完成時進行測量，每個循環(huán)后進行拷貝數(shù)定量。
實時 PCR 不需要額外的、冗長的終點檢測步驟，例如凝膠電泳，但為研究人員提供了比傳統(tǒng) PCR 更少的步驟的定量和定性樣品分析。該過程比標(biāo)準(zhǔn) PCR 成本更高，但該協(xié)議不那么費力，提供按需分析（用于時間敏感的研究），并且不易發(fā)生交叉污染。
在標(biāo)準(zhǔn) PCR 或常規(guī)終點 PCR 中，使用終點分析檢測 DNA 靶序列或擴增子，通常通過凝膠電泳完成。常規(guī) PCR 提供樣品的定性分析，但不提供定量評估。該過程比實時 PCR 成本更低，但該協(xié)議更長、更費力并且更容易受到樣品交叉污染的影響。
PCR儀包括與不同數(shù)量的微管、PCR 條和微孔板兼容的板塊。Biometra 的 TAdvance 熱循環(huán)儀具有快速更換、可互換的板塊，與 96 孔和 384 孔微孔板、0.5 ml 微管和 0.2 ml PCR 條兼容。Biometra 的 TRIO PCR儀具有三個不同的板塊，允許用戶靈活地并行運行三個獨立的 PCR 協(xié)議。Biometra TRIO 上的每個板塊最多可容納 48 個樣品。
