分離RNA時(shí)，良好的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)**關(guān)重要。與固定和神圣的DNA相比，RNA更不穩(wěn)定。具有核糖糖骨架的RNA含有高反應(yīng)性羥基（C-OH）基團(tuán)，確保鏈不斷制造，分解和重復(fù)使用。分離的RNA迅速降解，很容易被抗性酶核糖核酸酶（RNases）污染，這些核糖核酸酶隨處可見。
在本期Bench Bench中，我們采訪了舊金山加州科學(xué)院鳥類學(xué)和哺乳動(dòng)物學(xué)系主任兼策展人Jack Dumbacher博士，了解他的實(shí)驗(yàn)室目前的工作，即分離轉(zhuǎn)錄組和小RNA以鑒定宏基因組學(xué)病毒序列。與病毒作為病原體的典型觀點(diǎn)相反，病毒也可能與宿主具有共生關(guān)系或共生關(guān)系。了解鳥類中的這些進(jìn)化關(guān)系是Dumbacher的研究目標(biāo)之一。
“通常情況下，病毒顆粒是低豐度的RNA，”Dumbacher說(shuō)。“核糖體RNA（rRNA）可能是你**初選擇的很大一部分。為了獲得良好的恢復(fù)，我們嘗試通過(guò)在田間采集大樣本并盡可能小心地保存它們來(lái)提高RNA產(chǎn)量。“
學(xué)院的收集探險(xiǎn)通常發(fā)生在以生物多樣性而聞名的偏遠(yuǎn)地區(qū)，如熱帶森林或珊瑚礁。Dumbacher團(tuán)隊(duì)面臨的一大挑戰(zhàn)是，由于缺乏冷藏，無(wú)法用液氮快速冷凍樣品。（RNA在乙醇中穩(wěn)定降解，這是DNA樣品的常見防腐劑。）而是從鳥的泄殖腔（后消化道開口）擦拭樣品，放入RNA穩(wěn)定劑或含有4 M濃度的硫氰酸胍（GITC）緩沖液的其他混合物中。由于鹽含量，使用一些RNA穩(wěn)定劑可能難以在液體樣品中進(jìn)行RNA分離。保持冷藏鏈不是問(wèn)題，
傳統(tǒng)上，GITC緩沖液已被用于裂解RNA提取中的細(xì)胞和病毒顆粒，并通過(guò)暫時(shí)使RNA變性來(lái)同時(shí)防止RNase酶活性。在這種情況下，必須在裂解前進(jìn)行一些完整的病毒分離樣過(guò)濾，以避免核酸湯。Dumbacher團(tuán)隊(duì)收集的樣品主要是液體形式 - 需要很少的均質(zhì)化，但良好的分離很重要。在現(xiàn)場(chǎng)，該團(tuán)隊(duì)使用0.2μ過(guò)濾器 - 類似于旋轉(zhuǎn)柱中的過(guò)濾器 - 來(lái)過(guò)濾較小的病毒顆粒。像完整細(xì)胞一樣留下較大的顆粒。其他實(shí)驗(yàn)室使用冷凍組織樣本，必須快速?gòu)氐椎鼐|(zhì)化以獲得良好的恢復(fù)。無(wú)論選擇何種方法，都會(huì)保留一定量的基因組（gDNA）。
在實(shí)驗(yàn)室中，消除內(nèi)源和外源RNase與純化RNA之間的接觸始終是一個(gè)問(wèn)題。在RNA純化過(guò)程的早期，RNase的外部來(lái)源不那么具有威脅性。但是，在RNA制劑不再受GITC溶液等變性劑的保護(hù)后，RNA被純化后，您需要避免激活RNases。蛋白質(zhì)RNase抑制劑可以隔離剩余的RNase，適用于大多數(shù)應(yīng)用，特別是那些含有內(nèi)源性RNase的應(yīng)用。作為預(yù)防措施，每當(dāng)觸摸設(shè)備時(shí) - 應(yīng)更換玻璃器皿或移液器 - 手套。（用于RNA純化的玻璃器皿和器具的推薦培養(yǎng)時(shí)間在180°C**200°C時(shí)**少為4小時(shí)。）學(xué)院的比較基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室盡可能使用DEPC處理過(guò)的水代替分子級(jí)水。DEPC水通過(guò)堿基的組氨酸修飾使RNase失活。當(dāng)在室內(nèi)制造水時(shí)，建議事先對(duì)DEPC水進(jìn)行高壓滅菌，以降解DEPC。
如果您尚未指定提取，請(qǐng)開始跟蹤。RNA產(chǎn)量因不同組織和樣品而有很大差異。對(duì)于Dumbacher，收集的每個(gè)樣品通常RNA含量都很低。獲得的RNA量取決于鳥類**后吃的時(shí)間，吃的東西，以及其他化學(xué)物質(zhì)或細(xì)菌是否在起作用。“即使我們使用RNA含量非常低的樣本，當(dāng)你構(gòu)建你的庫(kù)時(shí)，它會(huì)非常令人印象深刻，你會(huì)看到你在另一端獲得了多少序列，”Dumbacher說(shuō)。（他的小組目前正在使用新一代測(cè)序技術(shù)來(lái)分離病毒序列。）
為了增加（先前RNA強(qiáng)健的）組織樣品中的RNA產(chǎn)量，避免過(guò)度均質(zhì)化或加熱。以30秒的休息間隔以30秒的脈沖均質(zhì)化可以改善RNA回收。此外，使用二氧化硅旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器時(shí)，用更多的水洗脫會(huì)從膜中釋放出更多的RNA。無(wú)論您的實(shí)驗(yàn)室使用何種下游技術(shù)，成功的分析都依賴于良好的RNA分離技術(shù)。實(shí)踐是**的。快樂(lè)解壓！
