蛋白質(zhì)印跡不是一門精確的科學(xué)，特別是在方法論意義上，直接獲得**的，出版物就緒的結(jié)果并不是常態(tài)。但是，您可以采取一些步驟來優(yōu)化Western印跡實驗，并確保它們能夠以**佳方式開始。這種微調(diào)過程稱為優(yōu)化，Western印跡方案的幾個階段可以從中受益。
您的蛋白質(zhì)印跡實驗早在您獲得膜之前就開始了。你可以追溯到樣品制備，但為了空間的利益，讓我們從樣品分離開始。通過這個，你可以得到你放入的東西 - 如果沒有一個好的凝膠，你將無法得到一個好的膜，它將從那里向下螺旋。如果你自己涂上凝膠，要特別注意確保化妝的均勻性。選擇正確的丙烯酰胺百分比（參見Proteintech的 Western blot協(xié)議 [PDF]）。通過抵抗在高電壓下運行凝膠的誘惑并使用等效體積的1x樣品緩沖液填充空孔，避免染色前“微笑”效應(yīng)。
**重要的是，加入均勻量的蛋白質(zhì); 通過測定確定蛋白質(zhì)濃度，并準備減少您的裝載量，如果您獲得“條紋”印跡。Proteintech驗證實驗室發(fā)現(xiàn)，每個泳道30μg蛋白質(zhì)通常會產(chǎn)生無條紋和良好分離的條帶。
您的膜選擇可以對Western印跡實驗的結(jié)果產(chǎn)生巨大影響。主要的兩種膜類型是PVDF和硝酸纖維素，但現(xiàn)在消費品市場上有幾種版本，包括例如針對基于熒光的免疫檢測優(yōu)化的膜或低分子量蛋白質(zhì)。
PVDF因其韌性，穩(wěn)定性和對大多數(shù)酸和堿的耐受性而受到重視（這意味著它是那些希望剝離和重新探測印跡的人的**膜）。PVDF膜還提供比硝酸纖維素更好的蛋白質(zhì)保留。
硝酸纖維素膜易于堵塞，通常可提供高信噪比。但是，你將無法剝離和重新探測它們。并注意硝酸纖維素膜的孔徑。
**后，關(guān)于實驗室傳統(tǒng)的一句話：不要害怕因?qū)嶒炇乙?guī)范而改變膜類型。嘗試不同的東西可能是**蛋白質(zhì)印跡的關(guān)鍵。
假設(shè)您已經(jīng)付出了所需的努力來 選擇您的抗體（Proteintech也提供了指南），您的下一步應(yīng)該是確定**佳的工作抗體濃度。
抗體與抗原之間的結(jié)合速率（親和常數(shù)）受其在溶液中的相對濃度（以及其他變量，如溫度和pH）的影響。抗原豐度通常在Western印跡中固定，因此您通常需要調(diào)整抗體濃度以獲得更好的印跡。以有組織的方式進行此操作 - 測試幾種稀釋的抗體，同時保持所有其他參數(shù)不變 - 將幫助您確定實驗的**佳抗體濃度。
此步驟稱為抗體滴定，應(yīng)在每次使用新抗體或一組實驗條件時進行。如果您注意到新批次的多克隆抗體與**后一批抗體的表現(xiàn)不同，也應(yīng)該這樣做。
如何滴定抗體
許多公司在其抗體數(shù)據(jù)表中提供了推薦的稀釋度，這些通常是很好的球場數(shù)據(jù)，可以幫助您入門; 然而，仍然建議滴定抗體，因為用于獲得推薦稀釋度的條件可能與您自己的非常不同。如果產(chǎn)品數(shù)據(jù)表建議使用1：1000的稀釋度，請嘗試1：250,1：500,1：1000,1：2000和1：4000的系列。
一般情況下，如果您將推薦的稀釋液加上推薦稀釋液的兩倍和一半稀釋液（另一側(cè)稀釋液稀釋液），您將處于正確的軌道上。如果沒有推薦的稀釋液開始，請嘗試1μg/ ml的純化抗體作為起點。請記住保持所有其他協(xié)議參數(shù)相同，例如樣品類型，孵育時間，洗滌時間和溫度。
關(guān)于二抗的說明
也許你必須嘗試不同濃度的二抗 - 特別是在化學(xué)發(fā)光檢測的情況下。HRP標記的第二抗體的濃度直接影響條帶的外觀。HRP酶太少會導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光信號低，光譜或光譜缺失。另一方面，過高的濃度會產(chǎn)生“燒壞”的條帶。這是由于襯底的快速耗盡導(dǎo)致中間沒有信號的帶。化學(xué)發(fā)光試劑孵育的長度也會有所不同（參見下面的＃6，檢測）。
可以使用各種阻塞緩沖區(qū)，這些緩沖區(qū)都不適用于所有情況。為每個抗體 - 抗原對嘗試幾種阻斷緩沖液是很重要的。請記住，基于乳汁的阻斷緩沖液含有內(nèi)源性生物素，糖蛋白和可能干擾信號的酶。例如，含乳的緩沖液含有活性磷酸酶，會破壞您對磷酸化蛋白質(zhì)的檢測; 在這些情況下，嘗試替代品，如牛血清白蛋白基阻滯劑。
在大多數(shù)情況下，每當我有高背景信號時，修改下一次貫穿的洗滌步驟已被證明是有用的。通常，我通過將吐溫-20濃度從0.05％增加到0.1％來實現(xiàn)這一點。您還可以使用以下任何一種策略來改變洗滌強度：增加洗滌時間和體積，執(zhí)行額外的緩沖液更換或使用更強的洗滌劑（例如，SDS代替吐溫20）。
檢測階段對于獲得良好的Western印跡信號是不可或缺的。有許多化學(xué)發(fā)光試劑和化學(xué)發(fā)光替代品，如熒光檢測 - 所以如果你目前的檢測方法不符合實驗室標準，有很多選擇。例如，您可以選擇具有更高靈敏度的試劑或產(chǎn)生更持久信號的試劑。后一種選擇將不可估量地增加印跡的再現(xiàn)性。
在更簡單的水平上，化學(xué)發(fā)光檢測可以通過膠片曝光時間進行優(yōu)化。這可能是**常執(zhí)行的優(yōu)化步驟，因為它快速而簡單。始終將您的墨水暴露在一系列單獨的時間點（但請記住，大約10到15分鐘后，所有HRP底物將用完）。你的電影選擇也會有所作為。我總是發(fā)現(xiàn)專門用于化學(xué)發(fā)光檢測的膠片 - 而不是任何標準的放射敏感膠片 - 是**佳選擇。
雖然熒光成像系統(tǒng)可能尚未供每個實驗室使用，但您所在機構(gòu)可能會提供核心或中心設(shè)施來提供此技術(shù)。基于熒光的檢測系統(tǒng)的直接優(yōu)勢是它們能夠同時檢測多種抗體，無需剝離和重新探測您的印跡。
或者，您可以完全跳過一級抗體的二次檢測，并簡化您的Western印跡方案，使用HRP結(jié)合的一抗識別常見的上樣對照和蛋白標簽。（以下列出的相關(guān)產(chǎn)品均以此格式提供。）
優(yōu)化的主要目的是增加特定波段的信噪比并減少非特定波段（如果存在）。不可否認，如果您選擇優(yōu)化上述所有變量，則需要花費大量時間; 然而，即使是一兩次改動也可能有所不同，從長遠來看實際上可以省時間。總的來說，我認為優(yōu)化是一項非常有價值的工作 - 如果你想獲得出版品質(zhì)的西方印跡，那么這是一項必要的策略。
