凝膠電泳染色:使用什么?
電泳是鑒定和分離大分子的常用實(shí)驗(yàn)室程序。它在19世紀(jì)初由莫斯科的一名大學(xué)科學(xué)家**觀察到。像許多發(fā)現(xiàn)一樣,這是偶然的,但已被證明對許多研究場景有用。通過施加電力,技術(shù)人員使用顆粒的負(fù)電荷或正電荷使其通過多孔基質(zhì)(例如瓊脂糖凝膠)遷移。當(dāng)樣品中存在帶正電的分子時(shí),它們會向負(fù)電流(陰極)蠕變,而帶負(fù)電荷的分子則會遷移到正電流(陽極)。
除了電力和凝膠的來源之外,此動力學(xué)測試需要緩沖劑以幫助防止溫度和pH極端值。所用凝膠的類型取決于樣品和應(yīng)用。凝膠是“固體”,但多孔。在凝膠中,較大的分子會移動得更慢,而較小的分子會快速移動。因此,分子大小是樣品分離和分子鑒定的另一種方式。
所以,現(xiàn)在我們了解了電泳的動力學(xué),我們?nèi)绾慰吹竭@些粒子在哪里移動?分子可能是“宏觀的”,但它們?nèi)匀惶《荒苡萌庋塾^察。我們實(shí)驗(yàn)的**后一個(gè)必要成分是染色劑。一組染料可以讓我們看到顆粒所走的路徑。從那里,我們可以捕捉圖像以記錄結(jié)果。
DNA凝膠染色
存在幾種用于在凝膠電泳期間染色核酸的選擇。溴化乙錠(EtBr)是**常用的DNA染料。它是一種嵌入劑,與DNA結(jié)合,當(dāng)暴露于紫外線時(shí)熒光增加20倍。EtBr是**便宜的DNA染色劑,使其成為許多研究實(shí)驗(yàn)室的理想選擇。但是,EtBr必須小心使用,因?yàn)樗且阎恼T變劑。此外,EtBr需要暴露于紫外線下才能看到,但會發(fā)生分子破壞。當(dāng)DNA被用于諸如克隆之類的下游應(yīng)用時(shí),這就出現(xiàn)了一個(gè)問題。
替代DNA染料,如SYBR Safe,已經(jīng)開發(fā)出來,它們不具有與EtBR相同的致突變性質(zhì)。SYBR Safe不被認(rèn)為是危險(xiǎn)的,可以使用實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)污水系統(tǒng)進(jìn)行處理。此外,它在藍(lán)光下發(fā)出熒光,防止使用紫外光時(shí)發(fā)生DNA損傷。
已顯示許多DNA染色劑抑制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。當(dāng)需要高PCR效率時(shí),如實(shí)時(shí)定量PCR,可行的DNA染色劑將是Eva Green。與其他常用電泳染料相比,它在較小程度上限制了PCR。伊娃格林也比傳統(tǒng)的污漬如EtBr更安全。
蛋白質(zhì)凝膠污漬
與DNA凝膠相似,染色蛋白凝膠有幾種選擇。兩種**常見的污漬是考馬斯亮藍(lán)和銀染。考馬斯是一種陰離子染料,它非特異性地與蛋白質(zhì)結(jié)合。一旦多余的污漬被去除,蛋白質(zhì)條帶就會顯現(xiàn)為藍(lán)色條帶。由于易于使用且價(jià)格合理,考馬斯染色法是蛋白質(zhì)染色**常用的方法。
相反,銀染比考馬斯用于檢測相對較低量的蛋白質(zhì)更敏感。但是,靈敏度帶來了一個(gè)代價(jià),因?yàn)殂y染色也能與多糖和核酸結(jié)合,在銀染凝膠上產(chǎn)生假帶。