聚丙烯酰胺凝膠制備
4.1 清洗玻璃板、灌膠用量筒和燒杯，玻璃板氣干(制膠用玻璃板為硫化玻璃，灌膠面必須干凈無水分，否則灌膠時(shí)容易產(chǎn)生氣泡；燒杯、量筒和玻璃板如果有水，由于膠與水不相溶，易使膠不能牢固粘在玻璃板上)；
4.2將平口玻璃板和凹口玻璃板放在桌面的支撐物（瓶蓋等）上，給玻璃板滴少量100%乙醇，用質(zhì)量好的紙均勻擦洗制膠面，氣干；
4.3 平口玻璃板和凹口玻璃板的三個(gè)邊均勻的涂抹適量凡士林（凡士林太多不容易清洗）；放上需要厚度的板條，此步應(yīng)注意密封好板條的相接處，用手將三邊和接茬處按牢固，否則容易漏膠；然后用夾子（夾子夾在板條中間）將玻璃板固定于灌膠架上；
4.4 配膠（8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，Acr:Bis=37.5:1）、灌膠;
將以下母液按量混合均勻保存于4℃，一般一周內(nèi)用完，
制膠及電泳
（1）膠板的準(zhǔn)備：首先確定兩塊玻璃板是否平整，用去污劑和清水將玻璃板洗滌干凈，并用蒸餾水沖洗，晾干后用95%乙醇擦拭。
1 用1～2 ml 95%的乙醇依次將長玻璃和短玻璃的正面擦拭干凈、均勻；（以平整、光滑的一面為正面）（**次用的玻璃板**好擦2～3次）
2 用加樣槍取1ml配置好的親和硅烷均勻分布于長玻璃的正面，用紗布涂抹均勻；（**次用的玻璃板**好用親和硅烷擦2～3次）
3 用加樣槍取0.5～1ml配置好的剝離硅烷均勻分布于長玻璃的正面，用紗布涂抹均勻；（擦**感覺特別光滑為止）
4 用1ml 95%的乙醇依次將長玻璃和短玻璃的正面擦拭均勻；（可使親和硅烷和剝離硅烷分布更未均勻，也可擦去多余部分）
5 檢查玻璃板正面有誤紗布絨毛之類的異物，若有，可吹走；取0.4mm的邊條，用紗布擦凈，置于長玻璃板的左右兩側(cè)，靠邊放置，將短玻璃板壓于長玻璃板上，調(diào)整邊條和短玻璃板的位置，使邊條剛好處于邊緣位置，但不突出，且長短玻璃板剛好對其，用夾子固定住玻璃板的兩側(cè)；以1×TAE配制1%瓊脂糖凝膠并封住玻璃板底部，待凝膠凝固后用醫(yī)用膠帶密封；將玻璃板凹槽向上小角度傾斜放置，準(zhǔn)備灌膠。
（2）制膠：稱取尿素21g，加入17ml雙蒸水加熱約二三十秒溶解，待冷卻后加入10ml 5×TBE，冰浴**冰手時(shí)加入7.5ml 40%丙烯酰胺（19:1），然后加入225μl 10%過硫酸銨和50μl TEMED，快速混勻，準(zhǔn)備灌膠。
（3）灌膠：用5ml加樣槍將制備好的膠液沿玻璃板中部緩慢加入到膠板玻璃板之間的空隙，注意不能在膠中形成氣泡（要多次實(shí)驗(yàn)以掌握技巧、控制加樣速度、調(diào)節(jié)玻璃板傾斜度、手按、豎起玻璃板、便輕敲變加樣等）。膠灌滿后，將鯊魚齒的平端插入膠液下5mm左右（不可過深，以免后面不能加樣；也不可過淺，以免上樣量過?。?，同時(shí)防止梳齒平端下方出現(xiàn)氣泡，于室溫下靜置2h，使膠完全聚合后使用。
（4）預(yù)電泳：撕去膠布，兩端平行用力拔出梳齒，將玻璃板和梳齒上的多余凝膠擦洗干凈，用蒸餾水漂洗玻璃板、梳子。將玻璃板裝到
電泳槽上，在下方
電泳槽中加入1×TBE**沒過玻璃板下端約1cm，裝好
電泳槽，加入1×TBE**沒過玻璃板上端約1.5cm處，用梳齒刮去玻璃板間隙間的碎膠，再用5ml加樣槍將其吹干凈，反轉(zhuǎn)梳齒，將鯊魚齒插入凝膠膠面下約0.5mm，并用夾子夾緊，梳齒間空隙即為加樣孔。120w恒功率，預(yù)電泳30min。
（5）點(diǎn)樣：點(diǎn)樣前用加樣槍吹吸每個(gè)上樣槽，將梳齒間隙間油狀液體吸干凈，以利于樣品更好的沉降。把DNA樣品與上樣緩沖液混合，每個(gè)加樣孔加5~7μl的擴(kuò)增產(chǎn)物。
（6）電泳：140-160w恒功率電泳，待溴酚藍(lán)**膠的四分之三處時(shí)（大約需要1.5~2h），終止電泳，回收電泳液（可重復(fù)用一段時(shí)間，當(dāng)發(fā)現(xiàn)電壓下降很多時(shí)要更換電泳液，或者補(bǔ)加蒸餾水可繼續(xù)用一段時(shí)間），取下膠板，將兩塊玻璃板輕輕分開，凝膠留在長玻璃板上。 銀染顯色
6.1 當(dāng)**染料接近膠底邊緣，電泳結(jié)束，也可使**染料跑出；關(guān)閉
電泳儀，
移去夾子，取下玻璃板，將膠從玻璃板上小心取下，切去一角或兩個(gè)角作為記號(hào)，以便于辨認(rèn)，然后開始銀染處理，處理均在搖床上進(jìn)行，具體步驟如下：
注：定影液——將膠在10%的醋酸中處理結(jié)束，可向醋酸中加入少許甘油(防止膠在干燥過程中發(fā)生膠裂)，搖勻，直接用作定影液；
銀染中應(yīng)注意事項(xiàng)：
① 水的質(zhì)量對染色效果影響極大，一般用超純水或雙蒸水，如果水含有污染物，膠可能不顯影或僅僅顯上部條帶；而下部空白；
② 顯影液中碳酸鈉的純度也很重要，建議使用無水碳酸鈉；
③ 由于溫度過高，顯影太快，所以為了便于控制顯影過程，一般將顯影液儲(chǔ)存
于4℃，用時(shí)取出；顯影液在4℃長期放置容易結(jié)晶，一般使用前1-2天配制即可，顯影液配制方法如下：
#p#分頁標(biāo)題#e#
④ 在10%的定影液加入幾滴甘油，可以用作**后的顯影液； ⑤ 每一步都應(yīng)該輕微搖動(dòng)，一般在搖床上進(jìn)行；
⑥ 銀染后在無離子水中的沖洗時(shí)間要求十分嚴(yán)格，一般在10秒左右，應(yīng)小于20秒，如果超過20秒，應(yīng)重新在0.2%的硝酸銀重新染30分鐘；
⑦ 0.2%的硝酸銀溶液可以重復(fù)使用6-7次，每次適當(dāng)延長銀染時(shí)間，**后可以在廢棄銀液中加入NaCl，使銀以AgCl2沉淀，過濾或重力沉淀即可以回收銀； ⑧因?yàn)椴蝗菀浊逑?，所以裝硝酸銀、顯影液和固定液及定影液的盆不能混用； ⑨電泳結(jié)束后，涂抹凡士林的玻璃板、板條用熱水浸泡后，用紙擦去凡士林，再清洗時(shí)比較容易洗凈，或浸泡后用洗潔精清洗即可。 7 包膠
將包膠用的玻璃板洗凈，玻璃紙?zhí)崆芭菰谒?0-60分鐘。包膠時(shí)，先在玻璃板上鋪一張玻璃紙，趕凈氣泡，四邊向下抹平；將膠放在玻璃紙上，再用另一張玻璃紙蓋在膠上，趕凈氣泡，四邊向下抹平，將玻璃板放在吸水紙上，在室溫（25℃）或恒溫箱中干燥（由于恒溫箱透氣性差，干燥過程慢），干燥好的膠可以用熱鋼鋸條封四邊；照相或干膠掃描。
