毛細(xì)管電泳迅速發(fā)展于80年代中后期,是分析科學(xué)中繼高效液相色譜技術(shù)之后的又一重大進(jìn)展，使分析科學(xué)得以從微升水平進(jìn)入納升水平，并使單細(xì)胞分析乃**單分子分析成為可能[1] 。毛細(xì)管電泳(CE)是一類以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)。廣泛應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)、多肽、藥物等大分子物質(zhì)的分析，但是，不同于毛細(xì)管電泳在無機(jī)離子 、有機(jī)小分子和生物大分子等方面取得的巨大成功，毛細(xì)管電泳在微生物方面的應(yīng)用在**近幾年才取得較大進(jìn)展，并逐漸顯現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。在微生物學(xué)領(lǐng)域，毛細(xì)管電泳除了在微生物基因測序方面得到廣泛應(yīng)用外，在微生物學(xué)檢測方面應(yīng)用的報(bào)道不多見。本文主要介紹了毛細(xì)管電泳的發(fā)展、原理、特點(diǎn)、分離模式及在微生物檢測中的應(yīng)用。  

1、 毛細(xì)管電泳技術(shù)  

1.1毛細(xì)管電泳發(fā)展歷史 

   1937年瑞典化學(xué)家Tiselius[2]利用電泳技術(shù)**次從人血清中分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白，并研制成**臺(tái)電泳儀，使電泳作為一種分離分析技術(shù)有了突破性的進(jìn)展。經(jīng)典電泳法**大的局限性在于存在焦耳熱，只能在低電場強(qiáng)度下操作，直接影響了其分離效率和分析速度的提高，為了解決這一問題，人們進(jìn)行了多方探索。1981年，Jorgenson和Lukacs[3]使用內(nèi)徑75um的石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳，成功地對(duì)丹酰化氨基酸進(jìn)行了快速，高效分離獲得了40萬塊/m理論塔板的高效率。這一開創(chuàng)性工作成為電泳發(fā)展史上一個(gè)里程碑，使經(jīng)典的電泳技術(shù)發(fā)展為高效毛細(xì)管電泳（HPCE）。從此，毛細(xì)管電泳在理論研究，分離模式，商品儀器，應(yīng)用領(lǐng)域等各方面獲得了迅猛發(fā)展。如今，HPCE可與GC、HPLC相媲美，成為現(xiàn)代分離科學(xué)的重要組成部分[4]。  

1.2毛細(xì)管電泳基本原理和分離模式 

按毛細(xì)管內(nèi)分離介質(zhì)和分離原理的不同，毛細(xì)管電泳有以下幾種分離模式[5]： 

    (1)毛細(xì)管區(qū)帶電泳 毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)的分離原理是基于各個(gè)分離物質(zhì)的凈電荷與其質(zhì)量比(比荷)間的差異而進(jìn)行物質(zhì)的分離。迄今CZE仍是應(yīng)用**多的模式，應(yīng)用范圍包括氨基酸、肽、蛋白、離子等的分離。（2）毛細(xì)管凝膠電泳 毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)是將平板電泳的凝膠移到毛細(xì)管中作支持物進(jìn)行電泳，不同體積的溶質(zhì)分子在其分子篩作用的凝膠中得以分離。常用于蛋白質(zhì)、寡聚核苷酸、核糖核酸、DNA片段分離和測序及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物的分析。（3）毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜 毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(MECC)是采用表面活性劑在運(yùn)動(dòng)緩沖液內(nèi)形成一疏水內(nèi)核，外部帶負(fù)電的動(dòng)態(tài)膠束相，利用溶質(zhì)具有不同的疏水性，在水相和膠束相間分配的差異進(jìn)行分離。主要用于小分子、中性化合物和藥物等的分離。（4）毛細(xì)管等電聚焦 毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)是用兩性電解質(zhì)在毛細(xì)管內(nèi)建立pH梯度，使各種具有不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)在電場作用下遷移到等電點(diǎn)的位置，形成窄的聚焦區(qū)帶。已成功用于測定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分離異構(gòu)體等。（5）毛細(xì)管等速聚焦 毛細(xì)管等速聚焦(CITP)利用先導(dǎo)電解質(zhì)和尾隨電解質(zhì)，使溶質(zhì)按其電泳淌度不同得以分離。現(xiàn)常用于富集樣品。（6）毛細(xì)管電色譜 將高效液相色譜(I-IPLC)中眾多的固定相微粒填充到毛細(xì)管中，以樣品與固定相之間的相互作用為分離機(jī)制，以電滲流為流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)力的色譜過程稱毛細(xì)管電色譜(CEC)。以上6種模式為毛細(xì)管電泳基本模式，此外，如親和、免疫毛細(xì)管電泳發(fā)展趨勢也很好。  

1.3 毛細(xì)管電泳特點(diǎn) 

   毛細(xì)管電泳與高效液相色譜一樣同是液相分離技術(shù)，但無論從效率、速度、樣品用量和成本來說，毛細(xì)管電泳顯示了一定的優(yōu)勢，與高效液相色譜相比，毛細(xì)管電泳柱效更高，可達(dá)105

-106  

理論塔板數(shù)/m，分離速度更快，幾十秒**幾十分鐘間完成，同時(shí)，它幾乎不消耗溶劑，而樣品用量僅為高效液相色譜幾百分之一，僅為幾十納升，毛細(xì)管電泳沒有高壓泵輸液，因此儀器成本更低，可以通過改變操作模式和緩沖液的成分，毛細(xì)管電泳有很大的選擇性，可以根據(jù)不同的分子性質(zhì)對(duì)生物大分子，藥物等極廣泛的分離對(duì)象進(jìn)行有效的分離，而高效液相色譜要消耗許多價(jià)格昂貴的色譜柱和流動(dòng)相[6]。當(dāng)然，毛細(xì)管電泳也存在一些不盡人意的地方，比如毛細(xì)管的填充需要專門的灌注技術(shù)且制備能力差，毛細(xì)管對(duì)樣本的吸附難于克服從而使其分離效率下降，電泳的高靈敏度依賴于高靈敏度的檢測儀等，這些都有賴于進(jìn)一步完善。  

1.4毛細(xì)管電泳---質(zhì)譜聯(lián)用 

毛細(xì)管電泳---質(zhì)譜聯(lián)用綜合了二者的優(yōu)點(diǎn)，成為分析生物大分子的有力工具，是近年來發(fā)展迅速的聯(lián)用技術(shù)。毛細(xì)管電泳---質(zhì)譜聯(lián)用的應(yīng)用與LC-MS的應(yīng)用在方法和分析對(duì)象上有許多相似之處，如都適用于小分子和大分子的分析，熱不穩(wěn)定，強(qiáng)極性分子及**離子型化合物的分離和分析，當(dāng)然，毛細(xì)管電泳---質(zhì)譜聯(lián)用尚存在缺點(diǎn)如濃度靈敏度低，不如LC-MS；不是所有的毛細(xì)管電泳分離模式都可方便地用于與質(zhì)譜相聯(lián)用；質(zhì)譜對(duì)毛細(xì)管電泳分離緩沖液的限制較多。同時(shí)，在將毛細(xì)管電泳體系與質(zhì)譜儀聯(lián)用時(shí)，還有以下問題需要注意[4]：（1）無論采用套液技術(shù)還是采用十字形接口，毛細(xì)管的出口處都會(huì)帶有高電壓。因此良好的電接觸對(duì)控制接口的工作電流乃**穩(wěn)定的離子化過程都是很重要的。（2）毛細(xì)管插入位置要經(jīng)細(xì)心的優(yōu)化，位置不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致電噴霧工作不穩(wěn)定。（3）以往發(fā)表的毛細(xì)管電泳分離工作多數(shù)都是在磷酸鹽緩沖液中完成的，在毛細(xì)管電泳和質(zhì)譜相連接時(shí)要調(diào)整為易揮發(fā)鹽的緩沖液。幾種適宜的緩沖液及其濃度：<100mmol/l的甲酸乙酸混合溶液；<50mmol/l的乙酸氨溶液；<10mmol/l十六烷基三甲基氯化銨溶液。（4）為解決毛細(xì)管電泳進(jìn)樣量小，不足以在質(zhì)譜上檢出的問題，可以采用等速電泳對(duì)樣品進(jìn)行柱上濃縮，以提高進(jìn)樣濃度。 #p#分頁標(biāo)題#e#

 

2、 毛細(xì)管電泳在微生物學(xué)中的應(yīng)用  

2.1 CE在病毒檢測中的應(yīng)用 

    病毒的檢測大多采用細(xì)胞培養(yǎng)以及免疫學(xué)方法，但是細(xì)胞培養(yǎng)是非常繁瑣的，而免疫學(xué)

方法也存在交叉反應(yīng)等問題。Erdman等[7]

將CE與RT-PCR聯(lián)合起來，建立了基于CE技術(shù)的基因掃描RT-PCR法來檢測患兒呼吸道中感染的6種常見的病毒。首先采用RT-PCR對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增，然后使用基于CE技術(shù)的ABIPrism 310基因分析儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因掃描分析。采用該法對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行了檢測，其中病毒培養(yǎng)或直接免疫熒光法而確定為陽性的93份樣本，該法86例陽性；而病毒培養(yǎng)或直接免疫熒光法判為陰性的116例病人，該法卻檢出了119株病毒。Margraf等[8]采用異源雙鏈核酸遷移率分析(HMA)并結(jié)合溫度梯度CE(TGCE)的方法對(duì)HCV進(jìn)行基因型鑒定。即采用RT-PCR對(duì)HCV 5 非轉(zhuǎn)錄區(qū)的一個(gè)56 bp的基因區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物和已知基因的擴(kuò)增子進(jìn)行雜交；然后對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行TGCE分析，依據(jù)不同的基因型產(chǎn)生的峰形差異進(jìn)行基因型鑒定。采用該法對(duì)已知的200個(gè)HCV的基因型進(jìn)行了鑒定，其中97％得到正確鑒定。還發(fā)現(xiàn)部分沒有得到正確鑒定的HCV基因型存在著基因變異。  

2.2 CE在細(xì)菌檢測中的應(yīng)用 

    細(xì)菌表面既包含正電荷基團(tuán)又包含負(fù)電荷基團(tuán)，因而細(xì)菌可被看成兩性物質(zhì)。細(xì)菌為膠體顆粒，表面積極大，而且覆蓋著許多物質(zhì)如多糖類、肽聚糖、脂類等。這些化合物在電泳

緩沖液中可因解離和吸附形成雙電層，因而毛細(xì)管電泳能將細(xì)菌當(dāng)作“離子”看待[9]

。細(xì)菌在一定的生理?xiàng)l件下，其表面基團(tuán)的電離狀態(tài)和雙電層的厚度是電泳緩沖液種類、pH值、離子強(qiáng)度和溫度等參數(shù)的函數(shù)，可以通過優(yōu)化這些參數(shù)分離不同種類的細(xì)菌。細(xì)菌在電泳過程中受電場力和摩擦力作用，其遷移時(shí)間可作定性的依據(jù)，其峰高或峰面積則是定量的基礎(chǔ)。毛細(xì)管電泳理論指出，分離柱效隨樣品分子擴(kuò)散系數(shù)或分子量的增大而上升，這就預(yù)示著CE在細(xì)胞分離中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。 

20世紀(jì)80年代以來，毛細(xì)管電泳技術(shù)在細(xì)菌分析、分離和鑒定中逐漸得到了運(yùn)用。1987年njerten等展示了CE在細(xì)菌分析方面的前景，他們成功地分離了干酪乳桿菌

(Lactobacillus casei)[10] 

。1988年,Uhlenbruck等人**利用毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行了分類 。與此同時(shí)，Ebersole和McCormick用毛細(xì)管電泳對(duì)糞腸球菌(Enterococcus faecalis)，化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)，無乳鏈球菌(Streptococcus 

agalactiae)，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)5種細(xì)菌進(jìn)行了分離，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段的菌體細(xì)胞對(duì)應(yīng)著不同的特征峰，而且大多數(shù)細(xì)菌在電泳后仍能保持活體狀態(tài)[11]

 。細(xì)菌電泳在實(shí)際操作中要獲得很好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性有一定難度。主要原因是細(xì)菌表面狀況因培養(yǎng)條件的不同而有差異；其次在電泳過程中，有些細(xì)菌細(xì)胞可能會(huì)破碎；同時(shí)細(xì)菌的代謝產(chǎn)物在表面的積累或釋放對(duì)電泳緩沖液也有影響；此外，細(xì)菌還可能在生長過程中形成緊密相連的聚合體。因此，細(xì)菌電泳的關(guān)鍵在于細(xì)菌的培養(yǎng)、緩沖液的選擇及樣品的前處理等[12]。 

   Armstrong等[13]**將毛細(xì)管等電聚焦技術(shù)用于細(xì)菌的分析分離，能在18min內(nèi)將E-coli、P．putida和深紅沙雷氏菌(Serratia rubidae)很好地分離，得到每米l，600，000理論塔板數(shù)的極限分離柱效。與常規(guī)等電聚焦相比，昂貴兩性電解質(zhì)的微量消耗和高效分離效果是其引人注目的優(yōu)點(diǎn)。但這種方式不能保證電泳分離后細(xì)菌的活性。在Armstrong研究組的工作中，以TBE—PEO緩沖液體系從人尿樣中快速檢測到引起尿路感染的病原菌腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)和E.coli 23501[14]。粉狀奶制品添加物中的活性菌嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)和藥片中的嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)也能快速定性定量分析[15]。不僅如此，他們通過對(duì)細(xì)菌進(jìn)行熒光染色，應(yīng)用激光誘導(dǎo)熒光檢測器，可將細(xì)菌的鑒定、濃度的測定和生理狀態(tài)的檢測在十幾分鐘內(nèi)的一次電泳中實(shí)現(xiàn)[16]   

2.3 CE在真菌檢測中的應(yīng)用 

   Turenne等[17]

將PCR和自動(dòng)熒光毛細(xì)管電泳系統(tǒng)相結(jié)合建立了快速鑒定真菌的方法，首先使用真菌通用引物1TS86、ITS4對(duì)各種真菌的ITS-2區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，然后采用自動(dòng)熒光毛細(xì)管電泳系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行分析，依據(jù)不同真菌問擴(kuò)增片段長度的差異而將其區(qū)分開。采用該法僅需不到7h就能完成，是一種適用于真菌血癥和其他真菌感染的診斷方法。Chen等[18]采用通用引物1TS3、ITS4對(duì)多種酵母的1TS2區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行分辨率達(dá)1bp的cE分析，依據(jù)擴(kuò)增片段的長度差異鑒定各種酵母。研究表明，92％ 的臨床菌株能夠被正確鑒定，剩下的8%通過ITS-2的測序或RFLP而被鑒定。后來Chen等[19]又采用引物ITS1、ITS2對(duì)酵母的1TSI 1區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行CE分析。結(jié)果表明，l9種酵母可以通過ITS-1區(qū)域擴(kuò)增片段的長度差異而得到鑒定。如果聯(lián)合ITS-1和ITS-2區(qū)域擴(kuò)增片段的長度差異，則可以鑒定30種酵母，其余的有相同長度擴(kuò)增片段的l0種酵母，通過ITS區(qū)域的測序或包含ITS-1和ITS-2區(qū)域的RFLP可以進(jìn)行鑒定。  

3 展望 

   毛細(xì)管電泳技術(shù)既是電泳分離技術(shù)的進(jìn)步，又是分析儀器運(yùn)用的創(chuàng)新。目前，毛細(xì)管電泳技術(shù)研究的重點(diǎn)在于擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，完善和發(fā)展應(yīng)用方法。相信隨著毛細(xì)管電泳技術(shù)的不斷進(jìn)步，它在微生物的分離、鑒別和定量分析發(fā)面將會(huì)取得更廣闊的應(yīng)用前景。#p#分頁標(biāo)題#e#