在早期，鄙人亦依據(jù)分子克隆的介紹，采用立春紅染膜。只是后來發(fā)現(xiàn)此操作不僅增加額外的操作時間，而且不能說明任何問題，于是拋棄之。首先，立春紅（也包括考染膠）的靈敏

度和HRP-ECL體系的靈敏度相差太遠，即使立春紅染膜無顏色，也無法提示W(wǎng)B結(jié)果會不會失敗（考染膠無顏色也不能說明轉(zhuǎn)膜充分了，除非你銀染），你仍然得繼續(xù)后面的操作；相反靶蛋白區(qū)域有顏色，亦無法提示靶蛋白就轉(zhuǎn)膜完全了，也許只是另外一個分子量大小相近的蛋白。因此，無論立春紅染膜失敗或成功，你都必須進行后續(xù)的操作。而立春紅染膠不僅增加額外的操作時間，而且增加一輪漂洗的操作，對膜和膜上的蛋白都不好。那么為什么不采用更直觀的預(yù)染marker做轉(zhuǎn)膜監(jiān)控的依據(jù)呢？理論上，同時轉(zhuǎn)膜、顏色是交聯(lián)到蛋白上的，因此顏色有多深表明有多少蛋白轉(zhuǎn)印到膜上，非常直觀、不會增加任何額外的操作（固定marker的上樣量非常必要）。當然上面提到針對PVDF膜，由于對小分子截留的局限，顏料分子會在高強度的轉(zhuǎn)印過程中從交聯(lián)的蛋白上脫落并穿過膜（顏料與蛋白交聯(lián)得過深會使整個lane糊掉；太緊（多）可改變蛋白構(gòu)象使遷移率改變。所以多數(shù)情況下顏料和蛋白之間是一種不穩(wěn)定的交聯(lián)，這意味著在某些條件下，顏料會從交聯(lián)的蛋白上脫落，又因為膜分子孔徑以及膜對不同物質(zhì)吸附能力的差異，顏料小分子會輕易穿過膜到濾紙背面，而蛋白則被牢固的截留在膜上），造成轉(zhuǎn)膜過度的假象。現(xiàn)在你知道有這種局限，要么更換NC膜；要么采用上面提到的非常穩(wěn)定的轉(zhuǎn)膜條件、注意必要的細節(jié)，就可從根本上忽略掉其對轉(zhuǎn)膜效率的指示，而把預(yù)染的marker僅僅作為一個分子量大小的指針，當然同時可確認之前的轉(zhuǎn)膜操作無誤（沒有插反電極，放反膜），也可為后續(xù)抗體孵育操作時膜的正反面做必要的提示。

不同公司預(yù)染的marker效果不太相同，一般NEB和invitrogen的常規(guī)分子量預(yù)染marker要上8-10ul，MBI的只要5ul（膠大小20×30cm），Biorad－mini3型（8.2×7.4cm)MBI**低2.5ul轉(zhuǎn)膜后就足夠清晰。