C.1 實驗試劑

(1) 1.5mol/L Tris‐HCl (pH8.8):取18.15g Tris, 加50ml 蒸餾水，緩慢的加濃鹽酸**pH8.8（約加3ml）；讓溶液冷卻**室溫，pH 將會升高，加蒸餾水**100ml。

(2) 1mol/L Tris‐HCl (pH6.8):取12.1g Tris, 加50ml 蒸餾水，緩慢的加濃鹽酸**pH6.8（約加8ml）；讓溶液冷卻**室溫，pH 將會升高，加蒸餾水**100ml。

(3) 10% (w/v) SDS: 取10g 的SDS，加蒸餾水**100ml。

(4) 20% (v/v) 甘油: 取20ml 100%甘油，加入50ml 蒸餾水。

(5) 1% (w/v) 溴酚藍:取100mg 溴酚藍，加蒸餾水**10ml，攪拌,直到完全溶解，過濾除去聚合的染料。

(6) 1 mol/L 的二硫蘇糖醇（DTT）：用20 ml 0.01 mol/L 乙酸鈉溶液（pH5.2）溶解3.09 g DTT，分裝成1ml 小份貯存于‐20℃。

(7) 30%丙烯酰胺溶液（配制含29% (w/v) 丙烯酰胺和1% (w/v) 甲叉雙丙烯酰胺的溶液100ml）在通風(fēng)柜中操作，取29g 丙烯酰胺，1 g 甲叉雙丙烯酰胺，加蒸餾水**100ml，緩慢攪拌直**丙烯酰胺粉末完全溶解，用石蠟?zāi)し饪冢稍?℃存放數(shù)月。

(8) 10%過硫酸銨：取0.5g 過硫酸銨，加入5ml 蒸餾水，可保存在密封的管內(nèi)，于4℃存放數(shù)月。

(9) 電泳緩沖液：取 3g Tris，14.4g 甘氨酸，1g SDS，加蒸餾水**1L, pH 約為8.3, 也可配制成10×的儲備液，在室溫下長期保存。

(10) 1×樣品緩沖液：將50μl 1mol/L Tris‐HCl (pH6.8)、200μl 10% SDS、500μl 20%的甘油、200μl二硫蘇糖醇（DTT）、100μl 1%溴酚藍和50μl 的去離子水于1.5ml ppendorf 管中，混合混勻，可在4℃保存數(shù)周，或在‐20℃保存數(shù)月。

(11) 考馬斯亮藍染液：1.0g 考馬斯亮藍R‐250，加入450ml 甲醇，450ml 蒸餾水及100ml 冰醋酸即成。

(12) 考馬斯亮藍脫色液：將 100ml 甲醇，100ml 冰醋酸，800ml 蒸餾水混勻備用。

C.2 分離膠的灌制

(1) 組裝凝膠模具: 按照DYCZ‐24DN 型迷你雙垂直電泳儀使用說明書裝配好灌膠用的模具。

(2) 本凝膠系統(tǒng)采用 15%丙烯酰胺濃度，線性分離范圍為12‐43KD，對于DYCZ‐24DN 型凝膠系統(tǒng)，一次性倒兩塊板所需要的分離膠的量為約10ml。將30%丙烯酰胺溶液5.0ml、1.5mol/L

Tris‐HCl (pH8.8)2.5ml、10% (w/v) SDS 0.15ml 和去離子水2.3ml 在一個小燒杯中混合，丙烯酰胺是神經(jīng)毒素，操作時必須戴手套。加入過硫酸銨0.1ml 和TEMED（N,N,N’N’‐四甲基乙二胺）0.004ml后，輕輕攪拌使其混勻(過量氣泡的產(chǎn)生會干擾聚合)。凝膠很快會聚合，操作要迅速。小心將凝膠溶液用吸管沿隔片緩慢加入模具內(nèi)，這樣可以避免在凝膠內(nèi)產(chǎn)生氣泡。

(3) 當(dāng)加入適量的分離膠溶液時(對于小凝膠，凝膠液加**約距前玻璃板頂端1.5cm 或距梳子齒約0.5cm)，輕輕在分離膠溶液上覆蓋一層1mm～5mm 的異丙醇，這使凝膠表面變得平整。當(dāng)凝膠聚合后，在分離膠和水層之間將會出現(xiàn)一個清晰的界面。
 

C.3 濃縮膠的灌制

(1) 本凝膠系統(tǒng)采用 5%丙烯酰胺濃度，對于DYCZ‐24DN 型凝膠系統(tǒng)，一次性倒兩塊板所需要的分離膠的量為約4ml。吸盡覆蓋在分離膠上的水后將30%丙烯酰胺溶液0.67ml、1mol/L Tris‐HCl(pH6.8) 0.5ml、10% (w/v) SDS 0.05ml 和去離子水2.7ml 在一個小燒杯中混合。加入過硫酸銨0.04 ml和TEMED 0.004ml，并輕輕攪拌使其混勻。

(2) 將濃縮膠溶液用吸管加**分離膠的上面，直**凝膠溶液到達前玻璃板的頂端。將梳子插入凝膠內(nèi)，直**梳子齒的底部與前玻璃板的頂端平齊。必須確保梳子齒的末端沒有氣泡。將梳子稍微傾斜插入可以減少氣泡的產(chǎn)生。

(3) 凝膠聚合后，小心拔出梳子，不要將加樣孔撕裂。將凝膠放入電泳槽內(nèi)，在內(nèi)外電泳槽中加入電泳緩沖液，使凝膠的上下端均能浸泡在緩沖液中。
 

C.4 制備樣品和上樣

(1) 將蛋白質(zhì)樣品與 1x 樣品緩沖液(10μl+10μl)在一個Eppendorf 管中混合。100℃加熱3min。10000 r/min 離心5min。

(2) 用微量注射器或 20μl 的移液槍將樣品15μl 加入樣品孔中。將蛋白質(zhì)樣品加**樣品孔的底部。 **后在所有不用的樣品孔中加上等體積的加樣緩沖液。

C.5 電泳
(1) 將電極插頭與適當(dāng)?shù)碾姌O相接。電流流向陽極。將電壓調(diào)**200V（保持恒壓；對于兩塊0.75mm 的膠來說，電流開始時為100mA，在電泳結(jié)束時應(yīng)為60mA；對于兩塊1.5mm 的膠來說，開始時應(yīng)為110mA，結(jié)束時應(yīng)為80mA）。

(2) 對于兩塊 0.75mm 的凝膠，染料的前沿遷移**凝膠的底部約需30～40 分鐘(1.5mm 的凝膠則需40 min～50min)。關(guān)閉電源，從電極上拔掉電極插頭，取出凝膠玻璃板，小心移動兩玻璃板之間的隔片，將其插入兩塊玻璃板的一角。輕輕撬開玻璃板，凝膠便會貼在其中的一塊板上。
 

C.6 考馬斯亮藍染色

這種染色方法在單條電泳帶中蛋白質(zhì)**小檢出量為0.1μg 的蛋白。通常可以根據(jù)所需要的敏感度來選擇是使用考馬斯亮藍染色或銀染色。

(1) 戴上手套避免將手指印留在電泳凝膠上，將凝膠移入一個小的盛有少量考馬斯亮藍(20ml 已經(jīng)足夠)的容器內(nèi)(小心不要將膠撕破)。或?qū)⒉ＡО暹B同凝膠浸在染料中輕輕振蕩直**凝膠脫落。

(2) 對于 0.75mm 的凝膠，可在搖床上緩慢震蕩5 分鐘~l0 分鐘，對于1.5mm 的凝膠，則需10 分鐘～20 分鐘，在染色和脫色過程中要用蓋子或封口膜密閉容器口。棄去染液，將凝膠在水中漂洗數(shù)次。戴手套以避免將雙手染色。

(3) 加入考馬斯亮藍脫色液(約50ml)，清晰的條帶很快會顯現(xiàn)出來，大部分凝膠脫色需要1h，使用過的脫色液則可用水沖洗掉。為了脫色完全，需數(shù)次更換脫色液并震蕩過夜。